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超滤离心管常见问题四(结果分析)

2021-9-27 17:43| 发布者: fmsci| 查看: 267| 评论: 0

摘要: Merck默克millipore密理博Amicon Ultra 超滤离心管结果分析的常见问题。

超滤离心管常见问题四(结果分析)

1.       蛋白在浓缩时出现了沉淀为什么?

蛋白如果浓缩过快或者过度浓缩都有可能引起蛋白沉淀。建议蛋白浓缩后的最终浓度不超过20mg/ml. 对于对浓缩速度敏感而容易沉淀的蛋白,建议的改进方法是:

1)离心力降为推荐离心力的30%-50%

2)改选择下一级过滤装置(如原本选用10K,此时可以选择30K

3)在浓缩过程中,取出超滤管,用枪头反复吹吸几次。

 

2. 浓缩后发现浓缩液中没有目的蛋白,可能的原因是?

首先,Amicon Ultra超滤管的最低起始蛋白浓度为25ug/ml.

请确保样本的起始浓度大于这个浓度。

其次,如果问题仍然出现。

请不要丢弃您的样本滤过液,

以做下一步分析:

1)如果样本在滤过液中,那么请排查:

a) 是否选择了合适截留分子量的超滤管(目的蛋白分子量的1/2或者1/3)?

b) 使用的离心力是否是在最高范围内?如果使用的是rpm,请换算成相应的g离心,

c) 离心机最近是否有校准过?

d) 是否首次尝试这个蛋白?如果能确保用同样的超滤管对其他蛋白成功操作的话, 那么有可能是目的蛋白的原因。有时蛋白会因其本身的一些特性(构象差异)而影响浓缩效果,建议选用上一分子量级别的超滤管(如原本选用30K,此时可以选择 10K)。

2)如果样本也不在滤过液中:

a) 样本起始蛋白浓度是否大于25ug/ml

b) 用来确定样本浓度的方法是什么?是否可信?

c) 目的蛋白是不是沉淀了?如果是,具体解决方法请参考上面的关于蛋白沉淀的相关解决方法。

 

3.用浓缩后的蛋白做下游分析时发现有干扰,可能原因?

Amicon® Ultra-4装置的超过滤薄膜含有微量甘油。如果此材料干扰分析,可用缓冲液或超纯水预清洗。如果干扰仍然存在,用0.1 N NaOH清洗,然后用缓冲液或Milli-Q® 水再次清洗后甩干。

 

4. 有时候用超滤离心管连水都离不下来,可能原因?

Amicon® Ultra-4装置的超过滤薄膜含有微量甘油。如果出现这种情况,先用0.1 N NaOH清洗再离心。最后用缓冲液或Milli-Q®水再次清洗后甩干。清洗后的滤膜应立即使用, 如暂时不用,请保持润湿状态,避免重新干燥。

 

5.使用超滤管对蛋白进行浓缩的过程中怀疑目的蛋白和膜之间可能存在非特异性吸附,如何改善这一现象?

超滤管使用的是再生纤维素膜的材质,拥有极低的蛋白吸附能力。但是对于一些疏水性蛋白或非极性蛋白,它们和膜的非特异吸附可能会增强,对于这种情况,客户可以尝试在实验前对超滤管进行封闭处理,详细步骤可联系厂家技术支持。

同时也可建议换成Amicon Ultra 0.5来进行实验,通过减小膜面积来降低非特异性吸附。

 

备注:以上信息仅供参考,具体信息说明及操作以厂家说明书为准。

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